文章速读
1、方法原理
生化需氧量是指在规定条件下，微生物分解存在水中的某些可氧化物质，特别是有机物所进行的生物化学过程中消耗溶解氧的量。此生物氧化全过程进行的时间很长，如在20℃培养时，完成此过程需100多天。目前国内外普遍规定于20±1℃培养5天，分别测定样品培养前后的溶解氧，二者之差即为BOD5值，以氧的毫克/升（mg/L）表示。
对某些地面水及大多数工业废水，因含较多的有机物，需要稀释后再培养测定，以降低其浓度和保证有充足的溶解氧。稀释的程序应使培养中所消耗的溶解氧大于2mg/L，而剩余溶解氧在1mg/L以上。
为了保证水样稀释后有足够的溶解氧，稀释水通常要通入空气进行曝气（或通入氧气），使稀释水中溶解氧接近饱和。稀释水中还应加入一定量的无机营养盐和缓冲物质（磷酸盐、钙、镁和铁盐等），以保证微生物生长的需要。
对于不含或少含微生物的工业废水，其中包括酸性废水、碱性废水、高温废水或经过氯化处理的废水，在测定BOD5时应进行接种，以引入能分解废水中有机物的微生物。当废水中存在着难于被一般生活污水中的微生物以正常速度降解的有机物或含有剧毒物质时，应将驯化后的微生物引入水样中进行接种。
本方法适用于测定BOD5大于或等于2mg/L，最大不超过6000mg/L的水样。当水样BOD5大于6000mg/L，会因稀释带来一定的误差。
2、仪器
1、恒温培养箱（20℃±1℃）。
2、5~20L细口玻璃瓶。
3、1000~2000ml量筒。
4、玻璃搅棒：棒的长度应比所用量筒高度长200mm。在棒的底端固定一个直径比量筒底小，并带有几个小孔的硬橡胶板。
5、溶解氧瓶：250-300ml之间，带有磨口玻璃塞并具有供水封用的钟形口。
6、虹吸管：供分取水样和添加稀释水用。
3、试剂
1、磷酸盐缓冲溶液
将8.5g磷酸二氢钾（KH2PO4），21.75g磷酸氢二钾（K2HPO4），33.4g七水合磷酸氢二钾（K2HPO4·7H2O）和1.7g氯化铵（NH4Cl）溶于水中，稀释至1000ml。此溶液的pH应为7.2。
2、硫酸镁溶液
将22.5g七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O）溶于水中，稀释至1000ml。
3、氯化钙溶液
将27.5g无水氯化钙溶于水，稀释至1000ml。
4、氯化铁溶液
将0.25g六水合氯化铁（FeCl3·6 H2O）溶于水，稀释至1000ml。
5、盐酸溶液（0.5mol/L）
将40ml(ρ=1.18g/ml)盐酸溶于水，稀释至1000ml。
6、氢氧化钠溶液（0.5mol/L）
将20g氢氧化钠溶于水，稀释至1000ml。
7、亚硫酸钠溶液（1/2Na2SO3=0.025mol/L）
将1.575g亚硫酸钠溶于水，稀释至1000ml。此溶液不稳定，需每天配制。
8、葡萄糖-谷氨酸标准溶液
将葡萄糖（C5H12O6）和谷氨酸（HOOC-CH2- CH2-CHNH2-COOH）在103℃干燥1小时后，各称取150mg溶于水中，移入1000ml容量瓶内并稀释至标线，混合均匀。此标准溶液临用前配制。
9、稀释水
在5~20L玻璃瓶内装入一定量的水，控制水温在20℃左右。然后用无油空气压缩机或薄膜泵，将吸入的空气先后经活性炭吸附管及水洗涤管后，导入稀释水内曝气2-8小时，使稀释水中的溶解氧接近于饱和。停止曝气亦可导入适量纯氧。瓶口盖以两层经洗涤晾干的纱布，置于20℃培养箱中放置数小时，使水中溶解氧含量达8mg/L左右。临用前每升水中加入氯化钙溶液、氯化铁溶液、硫酸镁溶液、磷酸缓冲溶液各1ml，并混合均匀。
稀释水的pH值应为7.2，其BOD5应小于0.2mg/L。
10、接种液
可选择以下任一方法，以获得适用的接种液。
⑴城市污水，一般采用生活污水，在室温下放置一昼夜，取上清液供用。
⑵表层土壤浸出液，取100g花园或植物生物土壤，加入1L水，混合并静置10min，取上清液供用。
⑶用含城市污水的河水或湖水。
⑷污水处理厂的出水。
⑸当分析含有难于降解物质的废水时，在其排污口下游3~8km取水样做为废水的驯化接种液。如无此种水源，可取中和或经适当稀释后的废水进行连续曝气，每天加入少量该种废水，同时加入适量表层土壤或生活污水，使能适应该种废水的微生物大量繁殖。当水出现大量絮状物，或检查其化学需氧量的降低值出现变更时，表明适用的微生物已进行繁殖，可用做接种液。一般驯化过程需要3~8天。
11、接种稀释水
分取适量接种液，加于稀释水中，混匀。每升稀释水中接种液加入量为：生活污水1-10ml；或表层土壤浸出液20-30ml；或河水，湖水10-100ml。
接种稀释水的pH值为7.2，BOD5值以在0.3-1.0mg/L之间为宜。接种稀释水配制后立即使用。
4、步骤
1、水样的预处理
⑴水样的pH值若超出6.5-7.5范围时，可用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH近于7，但用量不要超过水样体积的0.5%。若水样的酸度或碱度很高，可改用高浓度的碱或酸液进行中和。
⑵水样中含有铜、铅、锌、镉、铬、砷、氰等有毒物质时，可使用经驯化的微生物接液的稀释水进行稀释，或提高稀释倍数以减少毒物的浓度。
⑶含有少量游离氯的水样，一般放置1-2小时，游离氯即可消失。对于游离氯在短时间不能消散的水样，可加入亚硫酸钠溶液，以除去之，其加入量由下述方法决定。
取已中和好的水样100ml，加入1+1乙酸10ml，10%（m/V）碘化钾溶液1ml，混匀，以淀粉溶液为指示剂，用亚硫酸钠溶液滴定游离磺。由亚硫酸钠溶液消耗的体积，计算出水样中应加亚硫酸钠溶液的量。
⑷从水温较低的水域或富营养化的湖泊中采集的水样，可遇到含有过饱和溶解氧，此时应将水样迅速升温至20℃左右，在不使满瓶的情况下，充分振摇，并时时开塞放气，以赶出过饱和的溶解氧。
从水温较高的水域或废水排放口取得的水样，则应迅速使冷却至20℃左右，并充分振摇，使与空气中氧份压接近平衡。
2、不经稀释水样的测定
溶解氧含量较高、有机物含量较少的地面水，可不经稀释，而直接以虹吸法，将约20℃的混匀水样转移入两个溶解氧瓶内，转移过程中应注意不使产生气泡，以同样的操作使两个溶解氧瓶充满水样后溢出少许，加塞。瓶内不应留有气泡。
其中一瓶随即测定溶解氧，另一瓶的瓶口进行水封后，放入培养箱中，在20±1℃培养5天。在培养过程中注意添加封口水。
3、需经稀释水样的测定
⑴ 稀释倍数的确定：根据实践经验，提出下述计算方法，供稀释时参考。
① 地面水，由测得的高锰酸盐指数与一定的系数的乘积，即求得稀释倍数，见表2。
表2 由高与一定的系数的乘积求得的稀释倍数
高锰酸盐指数（mg/L） | 系数 |
<5 | —— |
5-10 | 0.2、0.3 |
10-20 | 0.4、0.6 |
>20 | 0.5、0.7、1.0 |
② 工业废水，由重铬酸钾法测得的COD值来确定，通常需作三个稀释比。
使用稀释水时，由COD值分别乘以0.075、0.15、0.225三个系数。
注：CODcr值可在测定COD过程中，加热回流至60min时，用由校核试验的笨二甲酸氢钾溶液按COD测定相同操作步骤制备的标准色列进行估测。
⑵ 稀释操作：
① 一般稀释法
按照选定的稀释比例，用虹吸法沿筒壁先引入部分稀释水（或接种稀释水）于1000ml量筒中，加入需要量的均匀水样，再引入稀释水（或接种稀释水）至800ml，用带胶板的玻棒小心上下搅匀。搅拌时勿使搅棒的胶板露出水面，防止产生气泡。
按不经稀释水样的测定相同操作步骤，进行装瓶、测定当天溶解氧和培养5天后的溶解氧。
另取两个溶解氧瓶，用虹吸法装满稀释水（或接种稀释水）作为空白试验。测定5天前后的溶解氧。
② 直接稀释法
直接稀释法是在溶解氧瓶内直接稀释。在已知两个容积相同（其差<1ml）的溶解氧瓶内，用虹吸法加入部分稀释水（或直接稀释水），再加入根据瓶容积和稀释比例计算出的水样量，然后用稀释水（或直接稀释水）使刚好充满，加塞，勿留气泡于瓶内。其余操作与上述一般稀释法相同。
BOD5测定中，一般采用叠氮化钠改良法测定溶解氧。如遇干扰物质，应根据具体情况采用其他测定法。
5、计算
1、不经稀释直接培养的水样
BOD5（mg/L）=c1-c2
式中，c1——水样在培养前在溶解氧浓度（mg/L）；c2——水样经5天培养后，剩余溶解氧浓度（mg/L）。
2、经稀释后培养的水样
式中，B1——稀释水（或接种稀释水）在培养前的溶解氧（mg/L）；B2——稀释水（或接种稀释水）在培养后的溶解氧（mg/L）；f1——稀释水（或接种稀释水）在培养液中所占比例；f2——水样在培养液中所占比例。
注：f1、f2的计算：例如培养液的稀释比为3%，即3份水样，97份稀释水，则f1=0.97，f2=0.03。
六、注事事项
⑴ 水中有机物的生物氧化过程，可分为二个阶段：第一阶段为有机物中的碳和氢，氧化生成二氧化碳和水，此阶段称为碳化阶段。完成碳化阶段在20℃大约需20天左右。第二阶段为含氮物质及部分氨，氧化为亚硝酸盐及硝酸盐，称为硝化阶段。完成硝化阶段在20℃时需要约100天。因此，一般测定水样BOD5时，硝化作用很不显著或根本不发生硝化作用。但对于生物处理池的出水，因其中含有大量的硝化细菌。因此，在测定BOD5时也包括了部分含氮化物的需氧量。对于这样的水样，如果我们只需要测定有机物降解的需氧量，可加入硝化抑制剂，抑制硝化过程。为此目的，可在每升稀释水样中加入1ml浓度为 500mg/L的丙烯基硫脲（ATU，C4H5N2S）或一定量固定在氯化钠上的2-氯代-6-三氯甲基吡啶（TCMP，Cl-C5H3N-C-CH3），使TCMP在稀释样品中的浓度大约为0.5mg/L。
⑵ 玻璃器皿应彻底洗净。先用洗涤剂浸泡清洗，然后用稀盐酸浸泡，最后依次用自来水、蒸馏水洗净。
⑶ 在两个或三个稀释比的样品中，凡消耗溶解氧大于2mg/L和剩余溶解氧大于1mg/L时，计算结果时，应取其平均值。若剩余的溶解氧小于1mg/L，甚至为零时，应加大稀释比。溶解氧消耗量小于2mg/L，有两种可能，一是稀释倍数过大；另一种可能是微生物菌种不适应，活性差，或含毒物质浓度过大。这时可能出现在几个稀释比中，稀释倍数大的消耗溶解氧反而较多的现象。
⑷ 为检查稀释水和接种液的质量，以及化验人员的操作水平，可将20ml葡萄糖-谷氨酸标准溶液用接种稀释水稀释至1000ml，按测定BOD5的步骤操作。测得BOD5的值应在180~230mg/L之间。否则应检查接种液、稀释水的质量或操作技术是否存在问题。
⑸ 水样稀释倍数超过100倍时，应预先在容量瓶中用水初步稀释后，再取适量进行最后稀释培养。
